晚期糖基化终产物对急性冠脉综合征血小板活性的影响及其机制

【摘要】冠状动脉粥样硬化斑块形成是导致冠心病的基础,而粥样硬化斑块的不稳定和急性血栓形成则是导致急性冠状动脉综合征(acutecoronarysyndrome,ACS)的关键环节。糖尿病是冠心病的独立危险因素。本研究结果表明糖尿病合并急性冠脉综合征患者的血糖水平较糖尿病合并稳定型心绞痛患者显著提高；在众多冠心病危险因素如年龄、血压、血脂等中,血糖相关指标异常与心肌酶谱异常升高关系最为密切；上述研究结果均提示了糖尿病合并冠心病患者罹患急性冠脉综合征的可能性较非糖尿病合并冠心病患者显著提高。血糖指标的提高与不稳定型心绞痛或非ST段抬高型心梗的关系较稳定型心绞痛与ST段抬高型心梗更为密切；更进一步地,冠脉造影下有血栓影患者的空腹血糖水平较冠脉造影下无血栓影患者显著性提高,结合上述研究结果我们推测高血糖可提高血小板活性并促进急性血栓形成。晚期糖基化终末产物(advancedglycationendproducts,AGEs)在糖尿病血管并发症发生发展中起关键作用,AGEs与其特异性受体RAGE(receptorsforadvancedglycationendproducts)相互作用调节下游的信号传导系统。我们通过Westernblot已证实血小板细胞膜上表达有RAGE,AGEs呈浓度依赖性地提高血小板的活性；血小板表面RAGE的表达亦随AGEs浓度提高呈现先递增后递减的趋势,然而未提示统计学意义,上述结果提示AGEs可提高血小板的活性。继而我们通过Westernblot发现AGEs呈浓度依赖性地提高PKCa的表达水平及磷酸化水平；而PKCβ1和PKCβ2的表达水平和磷酸化水平虽呈现一定程度的变化趋势,然而未提示统计学意义,因此我们推测AGEs可能通过调节PKCa的表达和磷酸化参与血小板的活化过程。此外,AGEs可呈浓度依赖性地提高血小板JNK的表达水平以及磷酸化水平,同时呈浓度依赖性地激活Caspase3的剪切,因此AGEs可能通过JNK-Caspase3这一凋亡相关信号传导通路调节血小板的激活过程。进一步地我们发现PKCa抑制剂可显著逆转AGEs对血小板的活化作用,然而对血小板膜表面RAGE表达水平则无显著影响；同时PKCa抑制剂可显著抑制AGEs对血小板JNK磷酸化的促进作用,并对抗AGEs对Caspase3的剪切激活,因此PKCa作为AGEs-RAGE的下游信号分子可能通过调节其下游JNK的磷酸化继而Caspase3的剪切激活而参与血小板活性的调节。综上,AGEs可能通过RAGE-PKCa-JNK-Caspase3信号传导通路调节血小板的活性水平,该结果从分子层面解释了糖尿病促进急性冠脉综合征急性血栓形成这一临床现象。第一部分糖尿病促进急性冠脉综合征的发生发展目的：探讨糖尿病是否对急性冠脉综合征急性血栓形成起促进作用。方法：我们选择了稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、非ST段抬高型心梗和ST段抬高型心梗患者共142例,收集其临床数据,分析临床背景资料；通过回顾性分析探讨急性冠脉综合征与糖尿病的因果关系；通过ANOVA检验分析空腹血糖、餐后2小时血糖、随机血糖和糖化血红蛋白等血糖相关指标与冠心病各类型之间的关系；通过相关性分析研究上述血糖相关指标与心肌酶谱及心功能指标之间的相关性；通过多元回归分析探讨在众多冠心病危险因素中血糖异常对急性冠脉综合征的影响程度；以ORIGIN空腹血糖目标(4-5.3mmol/L)为指导通过回顾性分析探讨在接受降糖治疗的前提下急性冠脉综合征与空腹血糖的关系。结果：卡方检验结果提示不稳定型心绞痛组、非ST段抬高型心肌梗死组和ST段抬高型心肌梗死组与对照组间非糖尿病和糖尿病患者构成比均无显著差异(P>0.05)。ANOVA分析结果表明非ST段抬高型心梗组的空腹血糖水平显著高于稳定型心绞痛组和不稳定型心绞痛组(P<0.05),而与ST段抬高型心梗组无统计学差异(P>0.05)。卡方检验结果提示,非糖尿病和糖尿病患者构成比在冠脉造影下无血栓影和有血栓影两组之间无显著性差异(P>0.05)；而空腹血糖在无血栓影组和有血栓影组之间则存在显著性差异(P<0.05)。Kendall相关性分析和Spearman相关性分析提示空腹血糖与CK-MB、cTnT、LDH、BNP在0.01水平上显著相关,与CK、LA在0.05水平上显著相关。多元回归分析提示血糖水平,尤其是空腹血糖水平对心肌酶谱的影响较其余冠心病危险因素更为显著。以ORIGIN空腹血糖目标(4-5.3mmol/L)为指导的回顾性分析提示在接受降糖治疗前提下急性冠脉综合征患者的空腹血糖水平显著高于稳定型心绞痛患者(P<0.05)。结论：高血糖对急性冠脉综合征发生发展和急性血栓形成起着促进作用。第二部分晚期糖基化终末产物提高急性冠脉综合征合并糖尿病患者血小板的活性及其信号传导机制目的：研究AGEs对血小板活性的影响及其信号传导机制。方法：抽取急性冠脉综合征合并糖尿病患者静脉空腹全血样本,制备富血小板血浆(PRP)并分为如下各组：对照组,AGEs低浓度组(20ug/ml),AGEs中浓度组(100ug/ml),AGEs高浓度组(500ug/ml);检测各组血小板聚集率,通过Westernblot检测各组血小板RAGE表达水平、PKCα、PKCβ1、PKCβ2和JNK的表达和磷酸化水平和Caspase3剪切活性。单独应用PKCa抑制剂Ro-32-0432或同时应用Ro-32-0432+AGEs干预血小板,检测血小板聚集率,通过Westernblot检测RAGE表达水平、PKCa和JNK的表达和磷酸化水平和Caspase3剪切活性。单独应用PKCβ2抑制剂CGP53353或同时应用CGP53353+AGEs干预血小板,检测血小板聚集率,通过Westernblot检测RAGE表达水平、PKCβ2和JNK的表达和磷酸化水平和Caspase3剪切活性。结果：AGEs呈浓度依赖性地提高血小板的活性；血小板表面RAGE的表达随AGEs浓度提高呈现先递增后递减趋势(P>0.05);AGEs呈浓度依赖性地提高PKCa表达和磷酸化水平(P<0.05),而对PKCβ1和PKCβ2则无显著影响(P>0.05);AGEs呈浓度依赖性地促进JNK表达及磷酸化和Caspase3的剪切激活(P<0.05)。PKCa抑制剂Ro-32-0432可显著逆转AGEs对血小板的活化作用；对血小板RAGE表达无明显影响(P>0.05)；Ro-32-0432可显著抑制AGEs对血小板JNK磷酸化的促进作用,并对抗AGEs对Caspase3的剪切激活(P<0.05)。PKCβ2抑制剂CGP53353对血小板活性、RAGE的表达、JNK和Caspase3的激活无显著性影响(P>0.05)。结论：AGEs可能通过RAGE-PKCa-JNK-Caspase3信号传导通路调节血小板的活性水平。结论1、高血糖对急性冠脉综合征发生发展和急性血栓形成起着促进作用。2、AGEs可能通过RAGE-PKCα-JNK-Caspase3信号传导通路调节血小板的活性水平。创新点和研究意义1、本研究提出血小板活性水平提高是糖尿病促进急性冠脉综合征发生发展的重要机制,血小板作为炎症细胞的重要来源之一在粥样斑块不稳定性和急性血栓形成中可能发挥重要作用。2、本研究首次提出糖尿病患者体内高血糖水平可能通过AGEs激活RAGE-PKCa-JNK-Caspase3信号传导通路从而提高血小板活性。3、本研究揭示了与传统ADP受体相关分子机制等不同的新的血小板激活信号传导机制,从而为糖尿病合并急性冠脉综合征患者抗血小板策略的开发研究提供新的分子生物学靶点和新思路。
【作者】杜绮钧；
【导师】葛均波；
【作者基本信息】复旦大学，临床医学（专业学位），2013，博士
【关键词】糖尿病；急性冠脉综合征；稳定型心绞痛；不稳定型心绞痛；非ST段抬高型心肌梗死；ST段抬高型心肌梗死；血小板；AGEs；RAGE；PKC；JNK；Caspase3；

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